Giovanni Trapattoni fick förnyat förtroende som tränare för Fiorentina säsongen 1999/2000. Nya spelare i laget var försvararen Daniele Adani (Brescia), mittfältarna Angelo Di Livio (Juventus) och Fabio Rossitto (Napoli) samt anfallarna Predrag Mijatović (Real Madrid), Abel Balbo och Enrico Chiesa (båda från Parma). För första gången deltog Fiorentina i Champions League. Laget slog ut polska Widzew Łódź i kvalet och i gruppspelet ställdes man mot Arsenal, Barcelona och AIK. Det blev en mållös premiär hemma mot Arsenal och sedan förlorade man med 4–2 borta mot Barcelona. Inte heller i tredje gruppspelsmatchen lyckades man vinna, utan fick nöja sig med 0–0 mot AIK på Råsunda, men sedan vände det. I returen hemma mot AIK blev det seger med 3–0 efter mål av Batistuta, Chiesa och Balbo och i nästa match gjorde Batistuta enda målet mot Arsenal på Wembley. Sista matchen hemma mot Barcelona slutade 3–3, vilket innebar att Fiorentina kom tvåa i gruppen och gick vidare till andra gruppspelsfasen. Där mötte man Manchester United, Valencia och Bordeaux. Fiorentina höll nollan i de tre första matcherna. Mål av Batistuta och Balbo gav en 2–0-seger i första matchen mot Manchester United. Det blev 0–0 borta mot Bordeaux och hemma mot Valencia gjorde Mijatović matchens enda mål på straff. Bortamatcherna mot Valencia och Manchester United slutade med förlust (2–0 och 3–1) och i sista matchen fick man 3–3 hemma mot Bordeaux efter att ha tappat en 3–1-ledning i slutet. Fiorentina slutade trea i gruppen och var därmed utslaget. I ligan slutade laget på sjunde plats. Gabriel Batistuta, som spelade sin sista säsong i Fiorentina innan flytten till Roma, gjorde 23 mål och kom på andra plats i skytteligan efter Milans Andrij Sjevtjenko.
Årets hemmatröja hade större inslag av vitt än tidigare och laget sponsrades nu av Toyota. Reservställen som användes var vita eller gula i samma stil som hemmastället.